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Immunomarquages en MET de protéines membranaires

Nous cherchons à réaliser des immunomarquages en MET de protéines membranaires (en surface, ou trans ou sous la membrane), ou cytoplasmique sur une monocouche de cellules endothéliales cornéennes situées en surface d’un tissu. Ces cellules sont donc facilement accessibles. Nous réalisons couramment des immunomarquages en microscopie optique nous réalisons couramment de la MET sur ces cellules Nous souhaitons désormais combiner les 2 pour confirmer la localisation subcellulaire de certains antigènes. Pour l’instant nous avons essayer un traitement des coupes ultrafines par H2O2 ou par hyperthemie à 95°C en tampon citrate, suivi du marquage. Les 2 traitements abiment bcp les grilles et les coupes. Gilles

En général, après réhydratation dans l’eau ultrapure (30 min), je réalisais un décapage avec NaIO4 (0.56 M) pendant 30 min suivi de deux bains d’eau ultrapure (10 min chacun), puis HCl (0.1 M V/V) pendant 10 minutes et pour finir je réalisais deux rinçages à l’eau ultrapure (10 min chacun). Le tout à température ambiante. Après suivaient la saturation des sites non spécifiques puis le marquage avec l’anticorps primaire.... Marjorie