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"Choisir un MEB environnemental ou à pression partielle

Thierry : je suis en quête d’avis et d’expériences concernant la "pertinence" ou non de choisir un MEB environnemental ou à pression partielle pour pouvoir observer des détails de structure de micro-organismes sans aucune préparation préalable des échantillons. J’ai beau rechercher des informations sur les performances de ce type d’appareil à ce sujet chez les principaux constructeurs, je ne trouve pas grand chose et ils ne semblent d’ailleurs pas en faire un argument de vente majeur (inquiétant !..). Pour information, j’ai la chance d’avoir un MEB (cathode froide) à effet de champ qui m’offre une excellente résolution (1,5 nm à 15 kV) mais qui travaille sous vide poussé. Ma question est donc de savoir si plus de 10 ans après ce modèle (datant de 1996), les dispositifs actuels (low vacuum ou environnementaux) permettent d’approcher une telle résolution sans avoir à passer par une préparation. Dans le cadre de plusieurs thématiques étudiées sur la plate-forme, nous cherchons à visualiser les détails de surface de micro-organismes présentant une "résistance" et une "fragilité" très variable et qui le plus souvent souffrent lors des préparations MEB. Parcourant la biblio depuis maintenant quelques temps, il semble que les modèles MEB fonctionnant sous vide partiel ou en mode environnemental ne permettent tout au mieux que de voir une cellule dans sa globalité (de l’ordre d’un x 15 000) sans pouvoir obtenir la même information de détail que j’ai actuellement. Aussi, je suis preneur de toute information sur le sujet, que ce soit de par votre expérience ou par vos connaissance des différents modèles existants sur le marché (points forts et point faibles). En vous remerciant par avance de l’éclairage plus juste et forcément plus complet que vous pourrez m’apporter sur ce sujet.

Pierre :

En fait dans votre message tout est dit ou suggéré sur la pertinence de l’utilisation des microscopes à balayage fonctionnant sous pression partielle. Je suis arrivé dans la microscopie électronique il y a maintenant plus de 35 ans et j’ai vu beaucoup de choses et notamment tous les progrès, les essais et les erreurs.

- 1) Penser que nous pourrons observer des échantillons avec beaucoup de détails sans faire d’efforts de préparation relève du fantasme. Mais au cours du temps des méthodes extrêmement puissantes et parfaitement adaptées à tous les types d’échantillons ont été proposées et sont parfaitement disponibles et maitrisées. Elles permettent de faire des observations de qualité, dont les images font références.

- 2) Les appareils, notamment les MEB FEG, ont fait des progrès fantastiques en terme de qualité et souvent ces progrès exceptionnels ne sont pas reconnus, comme si cela était parfaitement banal !

- 3) Les MEB environnementaux, après quelques années de recul, n’ont pas confirmé les espoirs que l’on avait mis en eux. L’absence de littérature et d’images de qualité sont là pour apporter de l’eau au moulin. Les entreprises communiquent d’ailleurs de moins en moins sur le MEB pression partielle et de plus en plus sur d’autres techniques comme le FIB.

Je pourrais dire encore plein de choses là dessus mais vos interrogations montrent bien le doute qui règne sur ces appareils et je contribue beaucoup à ces doutes.

Pour moi l’avenir est dans la haute résolution (ce qu’apporte le FEG), aux méthodes de cryo observation (très matures), aux métallisations haute résolution (comme le Chrome sous haut débit d’argon) ou le Platine en évaporation par canon électronique, aux détecteurs à haute sensibilité, etc. La pression partielle des MEB va devenir un accessoire secondaire, et ce type de MEB ne sera plus proposé dans un proche avenir.

Dimitri :

Pour la haute résolution il faut utiliser des techniques de préparation "modernes, associées aux MEB FEG - cathode froide de préférence.

Les MEB "environnementaux" et autres "low vacuum" ne permettent pas d’avoir des images correctes à grandissements plus que 35 - 40 000 fois. Au moins, pour l’instant mais sans trop d’espoir pour l’avenir.

Isabelle :

Nous sommes équipés depuis 2001 d’un MEB à pression contrôlée ; même s’il ne permet pas d’atteindre la résolution d’un MEB FEG il est certain qu’il nous a rendu de grands services pour l’observation de structures hydratées extrêment fragiles qui sont totalement détruites par les techniques classiques de préparation ; je citerai pour exemple le parfum des roses qui sans pression contrôlée n’avait encore jamais pu être observé ! Je ne pense pas qu’il n’y ait plus d’avenir pour ce type de microscope et qu’au contraire il peut être très utile dans de nombreux domaines.

Je profite de la question "MEB Pression partielle ou environnemental" posée par Thierry pour vous suggérer que cela peut bien constituer un sujet pour nos prochaines "Journées de formation"- à Perpignan évidement. Qu’en pensez-vous ?

Pour base de cette réflexion peut nous servir la réponse ci-dessous, donnée par Brigitte. Et j’aimerai bien également connaître la réponse de Claude.

Brigitte :

Je ne suis pas tout à fait d’accord avec les réponses de Dimitri et de Pierre. Bien que travaillant dans un domaine non biologique, je suis de temps en temps amenée à effectuer des prestations pour des chercheurs travaillant sur le vivant. L’appareil sur lequel je travaille, un XL 30 ESEM Philips, doté d’une cathode Kimball LaB6, est ancien, conception d’il y a plus d’une dizaine d’année, et son dispositif ne permet pas de voir des détails au niveau où vous le souhaitez. Mais le fait que le gaz introduit dans la chambre soit de la vapeur d’eau a permis à mes collègues des observations satisfaisantes sans aucune préparation de matériaux biologiques très divers, de bactéries aux larves de Nématodes qui ont résisté au vide partiel qui leur était imposé (3 mbar). Les appareils FEI QUANTA environnementaux actuels dotés d’une pointe FEG sont certainement capables d’atteindre les résolutions et les grandissements que vous souhaitez. Je pense que mon collègue Claude, de l’Université de Montpellier 2, pourrait vous renseigner puisque leur Centre Commun vient de s’équiper de ce type d’appareil et travaille le plus souvent sur des échantillons biologiques

Pierre :

J’ai vu passer quelques réponses complémentaires sur le service RCCM à la question posée par notre collègue. Je voudrais apporter quelques précisons à mes commentaires déjà diffusés.

- Si l’on parle de détails de structure, je sais que le MEB E ou PP ne sait pas faire cela (ou pas bien). Les électrons en PP diffusent trop pour donner une image à haute résolution.

- Si dans certains cas on souhaite simplifier sa technique de préparation on peut utiliser le MEB E ou PP, mais ceci se fera au détriment de la résolution et souvent de la qualité d’image (contraste, brillance)

- Je peux aussi dire de façon forte qu’il existe de très nombreux protocoles qui conservent parfaitement les structures les plus délicates, les plus hydratées et les plus fragiles. Ceci nous oblige à rechercher dans la littérature un peu ancienne, pas disponible en format PDF, et souvent pas citée par les méta moteurs de recherche bibliographique. Mais le RCCM est là pour nous aider à pister les protocoles, n’est-ce pas ?

D’autres voies comme la cryo observation nous garantissent simplicité des protocoles et haute résolution. Comme toujours ces appareils ont un cout ! Claude :

Je savais que l’acquisition d’un microscope environnemental m’attirerait quelques problèmes de ce style. Je suis étonné que vous puissiez comparer des images obtenues avec un microscope classique en haut vide avec des images en mode environnemental. On ne regarde pas du tout la même chose. En mode classique on regarde des structures qui certes proviennent de l’échantillon mais qui sont le résultat d’un point critique et d’une métallisation qui les ont pour le moins révélées. L’observation peut simplement parfois être un artefact de la technique de préparation. Mais la nature biologique est pareille au monde qui nous entoure elle est ronde de toute part et c’est ce qui fait son charme. Quand vous prenez un ballon parfaitement lisse et que vous le dégonflez légèrement vous lui découvrez de jolies structures, vous pourrez peut-être parler du squelette du ballon mais au départ c’est simplement des plis. Toujours est-il que si vous observez la matière biologique à des grandissements de 100 000 ce qui peut se faire sans aucun problème sur le dernier environnemental (le tout dernier) que le service vient d’acquérir, vous serez peut-être étonné de ne pas trouver de structures mais les raisons seront naturelles car lorsque vous observez des détails gorgés d’eau il n’y a plus de contours et je suis au regret de vous le dire : sans contour il n’y a pas d’image en noir et blanc.Par contre si vous voulez je peux vous fabriquer en mode environnemental des détails magnifiques juste en jouant sur la température et la pression, ce n’est pas un problème si vous tenez absolument à faire des photos à 150 000. Trêve de plaisanterie, cher Thierry je t’invite à venir chez moi (je n’habite pas chez une copine, en fait j’habite chez ma femme) faire des essais sur notre microscope environnemental dernier cris mais sache que tu ne pourras pas regarder du biologique dans son bouillon de culture il te faudra au moins le rincer. Amène ton matériel et ta problématique ça me fera progresser car je dois dire qu’ici sans avoir fait de publicités les chercheurs et surtout les étudiants sont impressionnés par le qualité de l’image même en mode en analytique où on fait des grandissements de 100 000 sans avoir métallisé. J’invite aussi tous mes collègues du RCCM à condition qu’on ne se retrouve pas à 74 comme à Nice.

Irène

J’ai moi-aussi cherché des informations dans ce domaine de la microscopie à pression contrôlée, sur des matériaux très divers d’ailleurs. Il m’a bien fallu me rendre à cette évidence : on a vraiment du mal à trouver des clichés à des grandisements élevés. La raison principale directement liée à l’état du matériel a déjà été évoquée (voir les différents échanges des 2 derniers jours). Mais je pense qu’il y a eu des améliorations récentes sur ces nouveaux MEB et sans-doute une évolution du savoir-faire, car j’ai constaté une qualité de photos bien meilleure dans des publications datant des 2 dernières années. Par expérience je sais aussi que beaucoup de documents d’excellente qualité finissent par ne jamais etre publiés pour des raisons diverses, alors, cela devient bien difficile de se faire une idée exacte ...et que chaque échantillon, chaque appareil et chaque manipulateur sont uniques ! Alors, la meilleure des solutions, c’est encore de tester par soi-même sur un échantillon que l’on connaît par ailleurs, et dans votre cas, cela ne devrait pas vous poser de problème. Faire des essais avec plusieurs appareils présents sur le marché est une expérience très enrichissante.

M. Muscariello, en conclusion de son article, résume la situation en notant : "Furthermore, based both on the published data available and on our laboratory experience, we believe that at the present moment, ESEM could not definitively replace SEM. More likely they appear to be complementary, as the former provides a real image of the sample, while the latter is still vital in resolving the finer structures in detail." Référence : MUSCARIELLO, L., F. Rosso, et al. (2005). "A critical overview of ESEM applications in the biological field." Journal of Cellular Physiology 205(3) : 328-334.

Mais j’imaginerai bien qu’un MEB, pression contrôlée FEG, cela doit etre pas mal.....(quand l’enveloppe financière suit !) Techniciennement Vôtre,

Jacqueline

Je voudrais rajouter mon grain de sel à cet intéressant débat. Je voudrais attirer votre attention sur le fait que les images que l on obtient aujourd hui en Meb proviennent de signaux différents, (électrons secondaires, rétrodiffusés, photons ou autres signaux électriques&., de détecteurs différents, placés dans des zones différentes de la colonne du microscope (sous l objectif, in lens, en position axiale ou latérale etc&. . Il existe chaque fois un problème de l interprétation de l image obtenue, de l analyse du contraste qui pour le même échantillon n est pas le même. Il devient donc très difficile d être catégorique sur la pertinence de l un ou l autre des dispositifs. Tout dépend du problème à résoudre, de la fragilité de la structure à étudier&

Ceci dit il est très intéressant d avoir de nombreux dispositifs différents, même si pour l instant c est un peu déstabilisant.

Il faut acquérir de l expérience avec chaque type de dipositifs, pour pouvoir en tirer le meilleur parti, qui n est sans doute pas le même chaque fois. Mais plusieurs approches sont toujours bénéfiques à la solution d un problème et lèvent souvent les ambigüités d interprétation.

Il commence à germer dans l esprit des physiciens, je crois que le GM-Meba réfléchit à cette question, d étudier et de comparer les différentes formations d images et de contrastes avec tous les nouveaux dispositifs, y compris également en tension élevée (supérieure à 15KV) ou normale (1KV à 15KV) et en basse tension (inférieure à 1KV). C est un débat de fond auquel les biologistes auraient tout intérêt à participer.

En conclusion, il ne faut à priori rejeter aucune de ces nouveautés, même si elles ne sont pas encore réellement de la routine, et ne remplace pas notre bonne vieille cuisine et un Meb conventionnel, Le problème est le même pour le Fib d ailleurs dont il a aussi été question.

L échantillon biologique est à priori incompatible avec la microscopie électronique, autrefois pour deux raisons, le vide et le bombardement électronique. Actuellement on s affranchit à peu près du problème de vide et on peut observer des échantillons hydratés, reste le problème du bombardement électronique qui détruit assez rapidement l échantillon. Il faut donc peut être encore accepter une petite partie de chimie pour stabiliser l échantillon, malgré nos rêves d observer directement l échantillon naturel.

Béatrice :

C’est vrai que ce débat est des + intéressant. Il rejoint les conclusions de l’étude menée par le réseau ReCamia sur la métallisation. Sur des échantillons non biologiques (type membrane de filtration) nous nous sommes rendu compte que chaque méthode d’observation apportait des informations. ces échantillons avaient été observés en MEB classique après métallisation, ou en mode low vaccum ou en mode ESEM (XL30 cathode chaude) ou à basse tension sans métallisation et même en AFM. Chaque mode a apporté des infos. Selon Mr Grillon, la meilleure façon d’observer un échantillon est de trouver sa tension d’équilibre et d’oublier la métallisation. C’est certainement la marche à suivre quand cela est possible (rarement pour les échantillons biologiques sans faire de fixation et de déshydratation avant) et particulièrement pour les nano-objets. Quant à la comparaison entre MEB classique et ESEM, je rejoins les différents commentiares déjà faits : il est vrai que même si les ESEM font des progrès 1- le contraste n’est pas le même, on ne regarde pas tout à fait la même chose 2- le bombardement électronique est encore très dommageable pour les échantillons bio surtout à fort grandissement, 3- la nature de certains échantillons biologiques ou de certains biopolymères (type chitosane) ne s’y prête pas (ex : je n’ai jamais obtenu de bonnes images de nématodes en ESEM, ces bestioles étant spécialisées dans la survie elle gardent l’eau et aucun détail n’est visible. pour le chitosane, la meilleure méthode s’est avérée être la cryoMEB). Nous préférons encore fixer les échantillons bio avant une observation ESEM. Je n’ai pas eu l’occasion de re-tester des cultures de cellules sur le XL30, si quelqu’un a des images... En conclusion : Sur les échantillons biologiques les méthodes classiques sont encore utiles, même si on peut parfois faire des adaptations entre techniques de MEB et ESEM. Si possible, il est bon de pouvoir comparer les infos obtenues avec différentes méthodes, nous proposons cela assez régulièrement à nos utilisateurs. il faut absolument que Claude qui a la chance d’avoir un nouveau micro continue à nous faire part des performances de ce micro !

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