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complex immnun outcherlony

J’ai une demande d’observation en Me d’un complexe immun ( albumine de boeuf- anti corps anti albumine) d’après l’expérience d’Oucherterlony réalisée sur gélose. Quelqu’un parmi vous a-t-il une expérience ou des conseils a donner pour imager ce complexe en MET. Isabelle AB 15/02/2011

Quelle idée curieuse ! L’albumine est trop petite (67 kDa) et ne se voit pas en ME. On s’en sert d’ailleurs de la BSA très diluée pour rendre les grilles hydrophiles. Donc si l’observation des Ig est hautement possible (spray sur mica, ombrage rotatif angle plat avec Pt/C), le complexe immun ne sera pas perceptible. La limite de visibilité des molécules est vers 100 kDa (mais là encore c’est sportif, mieux vaut 150 ou 200 kDa)). Manipe à oublier.Pierre

effectivement c’est pas très simple car la réaction Ac-albumine crée, par diffusion de chacune des parties, un précipité dans la gélose qu’il est certainement très difficile de reprendre. Ce qui peut-être essayé c’est de découper le précipité dans sa gélose et d’essayer de laver cela dans un peu de tampon et regarder par coloration négative ce qu’il est possible de voir. Je crains que ce ne soit qu’un précipité trop dense qui ne laisse pas voir grand chose. En solution ou en ouchterlony on obtient une immunoprécipitation et qui dit précipité dit pas voir grand chose. Même en cryo-coupe du précipité dans sa gélose ne permettrait pas de voir grand chose non plus, je pense. Donc là je te rejoins Pierre l’idée d’espérer pouvoir observer quelque chose est sûrement à revoir à la baisse. Par contre je vais un peu te contre dire Pierre, tu ne m’en voudras pas, je dis (parce que je l’ai fait à une époque qui s’éloigne) qu’on peut voir des complexes Ag-Ac en suspension avec la coloration négative en utilisant préférentiellement la méthode de Valentine (1968) l’antigène étant de très petite taille, style albumine ou à peine plus gros avec des anticorps monoclonaux. La condition c’est de ne pas être situation de précipitation. Des IgG seuls et des molécules de très petite taille comme l’albumine peuvent être observées par cette même méthode qui marche très bien pour tout ce qui est très petit pour plus gros évidemment aussi et plus facilement encore surtout quand on atteint, comme tu dis Pierre, la centaine de kDa. L’agent de contast le meilleur pour cela c’est l’acétate d’uranyle à 1 ou 1.5% p/v. Une des difficultés majeures c’est de trouver la bonne dilution pour ces petites molécules car si c’est trop concentré on ne voit rien et si c’est trop dilué c’est pareil, entre 10-20 micro-g/ml en principe c’est pas mal. En tampon Tris c’est toujours mieux qu’en phosphate (quand c’est possible). En fait vous ne verrez pas grand chose que de toutes petites billes claires sur un fond sombre pour un objet comme l’albumine.

La référence de Valentine à laquelle je fais allusion et qui m’a bien servie fût un temps et encore aujourd’hui, date un peu ...1968 si cela dit quelque chose à certains. Rassurez-vous j’ai commencé quelques années après mais peut-être pas tant que çà finalement. Valentine et al. : Regulation of Glutamine Synthetase XII. Electron Microscopy of the Enzyme from E.Coli . Biochemistry 7 , 2143-2152 Pierre-Yves

Une petite idée comme ça en passant ; pourquoi de pas coupler votre BSA à des particules d’or colloïdal (taille de l’ordre du nanomètre) ?Vous déposez la BSA-"gold" sur la grille puis vous faire votre reconnaissance Ag-Ac puis contraste. De cette façon vous évitez les agrégats d’une réaction en tube à essai mais vous avez dez complexes immuns autour des particules.

J’ai aussi pensé à des billes de polystyrène/agarose/autre ? (taille de l’ordre du micron) mais ça va être énorme.

Ma première idée venue étant l’or colloïdal, vous pouvez préparer des particules d’or colloïdal par réduction de Au3+ (à partir de HAuCl4), couplage à la BSA puis purification. Pour la recette, je vous renvoie sur la page de l’excellent site de Paul Webster sur la microscopie électronique (http://www.hei.org/research/aemi/go...). J’en avais fait il y a une dizaine d’année pour coupler de la HRP. Ce genre de complexes (BSA-, HRP- "gold") est très utilisé en biologie cellulaire pour étudier la voie endocytique par leur internalisation. Nicolas B

les images que tu montres Isabelle, je les connais très bien et je dirais même que je les reconnais puisque ce sont des images que j’ai faites dans les années 1980 lors de ma période de collaborations avec l’équipe de J. Lamy. Ce document est issu d’une synthèse sans doute, je ne connais pas son existence et fait-il référence aux articles dans les quelles ces images sont exploitées ? Je confirme qu’elles sont bien réalisées en coloration négative. Pour les immuns complexes les plus gros avec des macromolécules (Hemocyanines ici) une méthode de coloration négative très classique convient. Pour l’ IgG seul, montré là et de plus petites molécules impliquées ou non dans des immuns complexes, je réitère mon conseil, la méthode de Valentine est celle qui d’expérience pour moi est la meilleure (je ne dis pas que c’est facile). Dans ce qui est montré, les anticorps sont des monoclonaux, les réactions Ag-AC sont en milieu liquide et une étape de filtration sur gel par exclusion diffusion est nécessaire pour éliminer les IgG en excès donc non fixés. Le but est aussi d’obtenir un fond de préparation propre. Le problème pour toi est de récupérer un immuncomplexe obtenu d’une diffusion des protagonistes dans un support "solide". Les anticorps sont sans doute des polyclonaux donc tu récupères au mieux un précipité qui ne te laissera pas voir grand chose. Pour récupérer quelque chose je ne sais pas si ce serait réalisable de découper la gélose à proximité de l’arc, pour ménager un puits de petit volume, le remplir d’un tampon et planter des électrodes pour faire migrer le précipité vers ce volume...Si vous avez les coordonnées de MacGyver. En conclusion : visualiser des immuncomplexes à partir d’un ouchterlony, tu risques d’y passer un long moment pour rien. je pense que tes interlocuteurs comprendront. Tout cela nous aura permis d’évoquer la méthode de Valentine qui peut servir pour beaucoup d’autres petites choses c’est certain. P-Yves