Accueil du site ¦¦

membrane de formvar

Mars 2011

Je m’adresse à vous tous suite à des problèmes assez récurrents que je rencontre avec mes films butvar et/ou formvar.

_La technique que j’utilise pour la réalisation de ces films est la suivante :_ - préparation des solutions à 1% dans du chloroforme en volume conséquent (250mL, solutions conservées à RT à l’abri de la lumière pour utilisations futures), agitation sur la journée pour une meilleure dissolution - utilisation de lame "pearl" prénettoyées avec simple essuyage avec du papier fin. - utilisation d’une burette pour assurer la constance du dépôt sur la lame de verre - décollement sur l’eau - dépôts de grilles préalablement nettoyées dans du chloroforme - récupération à l’aide de parafilm

Avec cette technique, je n’ai aucune régularité dans la production de mes films, la manip n’est pas reproductible. Les décollements sur l’eau se font difficilement. De plus, mes films sont très souvent sales, et sont très régulièrement parsemés de microtrous que bien entendu je retrouve sous le faisceau et qui viennent me gêner dans mes observations. J’ai également remarqué que mes films vieillissaient très mal, plus fragiles dans le temps, et beaucoup plus troués et sales !!!

Je voulais avoir vos avis sur la technique employée. Est ce que mes problèmes viennent de mes solutions qui peuvent être trop vieilles, de mes lames qui ne sont pas forcément propres, etc ? Avez vous déjà eu ce genre de problème ? Quels sont vos secrets de fabrication ? Sabrina

Plus on veut bien faire et moins cela marche ! La méthode qu’il faut utiliser et les recommandations à suivre sont décrites dans un bouquin remarquable (il faut l’avoir dans son labo) de Arvid Maunsbach et Bjorn Afzelius, Biomedical Electron Microscopy : http://www.amazon.fr/Biomedical-Ele... N’ayant pas de scanner, je ne peux pas vous donner cette page qui change tout dans la vie du microscopiste. Mais je peux vous la faxer sur demande !

Quelques remarques sur ce qui est dit dans le protocole ci-dessous. Plus vous frotter la lame, moins cela se décolle (électricité statique !), donc on ne frotte pas ! Formvar 0,35% dans CHCl3 et non 1% donnant films trop épais et rigides, fragiles à terme !! Le CHCl3 doit être pris dans un flacon neuf, récent. Acheter en petits volumes ; Pierre

- Je fais des films à 0,4 % formvar dans du chloroforme. Si la solution contient de l’eau, il y aura formation de petits trous dans le film. C’est d’ailleurs comme cela que l’on peut faire des "holey" grilles en ajoutant de l’eau dans la solution et en agitant très fortement pour avoir des microgoutes d’eau dans la solution.
- J’utilise des lames de microscopie normale nettoyé à l’eau distillée puis éthanol.
- Je n’ai pas de burette pour faire couler régulièrement la solution, mais une jarre de coplin d’où je retire la lame manuellement. Évidement il y a des raies parallèles tout le long du film visibles à l’oeil (différentes épaisseurs) mais au microscope électronique la différence est invisible.
- J’utilise une lame de rasoir pour couper le film sur la lame en haut et en bas et je racle sur les deux cotés la tranche de la lame, ceci sur les deux cotés de la lame.
- J’utilise un cristallisoire de 10 cm de haut rempli d’eau dans lequel je plonge la lame verticalement. Les deux films se séparent d’un coté et de l’autre. Arrivé en haut du film découpé je laisse plonger la lame dans le cristallisoire (d’où sa hauteur). Je ne retire plus la lame par le dessus parce que parfois en sortant la lame de l’eau les films reviennent se coller sur elle.

- aussi, juste avant de plonger la lame dans l’eau, je fais de la buée sur le film avec ma bouche. D’ailleurs c’est aussi une façon de retrouver un film très fin qui flotte sur l’eau et qui est très difficile à voir pour y déposer les lamelles. Je pose mes grilles et je récupère avec du parafilm.

A faire par temps sec ;-) Nicolas

J’ai une petite astuce pour avoir une épaisseur homogène : au lieu de drainer la solution, je fais remonter la lame de verre. Pour avoir une vitesse de montée régulière, j’attache cette lame à un fil, lui-même enroulé autour de l’axe d’une pompe péristaltique. On peut régler le débit des ces pompes, c’est-à-dire la vitesse de rotation. Très pratique, pas cher si on a une pompe au labo et surtout, on ne s’ennuie pas à nettoyer les cuves à décantation. On peut prendre un bécher propre à chaque fois.Yannick

Après relecture de votre message, j’ai oublié quelques détails :

Je fais un petit volume(50 ml en fiole jaugée) d’une solution stock à 2 % dont je fais un petit volume (50 ml + petit extra pour remplir ma jarre) de solution de travail à 0,4 %. Le tout est conservé à l’abri de la lumière, bien que j’ai aussi conservé un temps mes solutions à la lumière sans avoir rencontré de problème.

Je met l’eau à raz-bord dans le cristallisoir et je racle la surface avec une longue tige en verre pour enlever les saleté à la surface de l’eau.

Mes grilles sont nettoyer à l’acétone. le top est aussi une petite sonication.

Enfin si j’avais un évaporateur de carbone, je rajouterai une petit couche (quelques nm) pour solidifier le film.

Voilà tous mes secrets. Je donne aussi des cours et mes élèves de Gif-sur-Yvette pourront confirmer la qualité de mes films ;-) Nicolas

nous nous suivons le protocole décrit par J Boumendil (Principes et méthodes de préparation - edition Inserm), le formvar est dilué dans le dichloro 1-2 ethane à 0.4%, je dépose qqs gouttes à l’extrémité de la lame et je les étire avec une barre de verre nettoyer dans le diluant comme pour faire un smear . pour les lames, pour en avoir parlé avec Samia (DeltaM) je prends les moins chers pas traitées rien, juste trempées avant utilisation dans le diluant, je les sorts je laisse évaporer et c’est tout, et comme Nicolas je souffle un peu de buée avant de plonger la lame dans l’eau Christine

la méthode que j’utilise n’est pas éloignée de ce que chacun a exposé, la différence est dans le choix du solvant, je dissous le formvar à 0,3% dans du dichloro 1-2 éthane. Cette solution se conserve bien. Le mouvement régulier en remontant ne pose pas trop de problème mais belle idée Yannick ! mais un petit coup de schnaps (avec modération) permet aussi de s’affranchir des tremblements source de variations d’épaisseur. Je ne dis pas non plus que j’ai toujours un flacon à portée de mains...

P-Yves