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surfixation gluta

Avant d’être évacué, j’avais fixé des cyanobactéries au gluta (2,5%) dans du cacodylate de sodium en présence ou pas de bleu alcyan et de rouge de ruthénium (cf conférence de Thierry Meylheuc, Nantes 2010) pour une observation en MEB. je vais sans doute aller rincer ces échantillons par dessus les barricades (les étudiants nous laissent gérer les urgences). Ma question concerne le temps maximum de fixation de vos échantillons en gluta ? Didier

La fixation dépend entre autres, de la nature et également de l’épaisseur de l’échantillon. En théorie, il faut compter 1h pour fixer en gluta 1 mm d’épaisseur. Mais ce qu’il ne faut pas oublier non plus ce sont les paramètres, pH et osmolarité. Ces derniers, s’ils ne sont pas contrôlés, ils sont à l’origine des dommages chimiques des échantillons. Revenons au temps de fixation, si le temps de fixation en gluta est très long et que la fixation est réalisée à température ambiante, par conséquent variable, il est possible de brûler l’échantillon. La question qui se poserait est si on fixe longtemps, à quelle température faut-il le faire ? Devons-nous fixer à température ambiante ou 4°C ? Dans mon expérience, quand je fixais mes biopsies(environ 4mm d’épaisseur et 2mm de longueur) je le faisais à 4°C pendant 4h (gluta 2,5%). Pour des prélèvements d’organes de souris, la fixation en gluta 2,5% était réalisée également à 4°C pendant toute la nuit, avec ajout également de PFA dans la solution de gluta 2,5%. Amena

La réaction chimique par les aldéhydes est une réaction d’addition (globalement sur les groupements peptidiques). Quand il n’y a plus de radicaux disponibles, la réaction s’arrête. Il n’y a donc pas de sur-fixation avec les aldéhydes. De plus si le tampon est fort et adapté, il ne devrait pas y avoir de soucis. Je me rappelle avec émotion d’échantillons de matériel infecté VIH fixés avec du fixateur fait par moi, sélectionnées par Francoise Barré-Sinoussi au Cameroun, bloqués en douane, bloqués par les sécurités avion, restés des jours sur le tarmac en pleine chaleur... Finalement traités pour la ME à Paris. Je n’ai jamais rien vu de plus beau ! La situation est très différente pour les oxydants (ruthénium, osmium, etc...). La réaction ne s’arrête jamais ! Le résultat peut être très bizarre  ! A éviter absolument. Attention au gaz CS (chlorure de malononitrile) ! Pas bien meilleur que le formol ! Pierre

Je vois donner quelques indications sur la fixation par les aldéhydes et tenter de tordre le cou à quelques pesanteurs de laboratoire (n’est-ce pas Pierre Yves ?). Le glutaraldéhyde pénètre à la vitesse de 1mm/h (donc pour une pièce de 2 mm, il faut une heure car cela rentre par tous les côtés). C’est une réaction d’addition dont la vitesse est fonction de la concentration mais surtout de kT. T, c’est la température donc plus rapide à T°C ordinaire qu’à 4°C ! La concentration souvent utilisée est 2,5% (car solution à 25%). Si c’est cela la raison, c’est certainement la plus mauvaise raison du monde ! Le fixateur à 2,5% Ga + tampon 0,1M est toujours trop hyper osmolaire (valable pour tissu animaux) soit 450 mOsm pour 320 -330 mOsm (osmolarité normale des tissus et cellules en culture) Donc, c’est trop, beaucoup trop ! Le bon calcul mène à 1,6% Ga + Tampon 0,1M soit 360 mOsm (très légèrement hyper osmolaire). Le tissu ne perd pas trop d’eau et ne se contracte pas trop ! Et avec les aldéhydes, comme j’ai déjà dit quand c’est fini, c’est fini. ! L’ajout de PFA n’apporte rien sinon de l’osmolarité considérable (100 mOsm par %, soit 400 mOsm pour 4% PFA), et pénétrant plus vite va limiter la fixation par Ga (compétition aux niveaux des radicaux peptidiques). Autres vitesses : Formol 4 mm/h ; OsO4 0,4mm/h Pierre